Vladimiro Kosic, Assessore regionale alla Salute, e Guido Martinelli, Direttore della Scuola Internazionale di Studi Scientifici Avanzati di Trieste, per la prima volta in visita a Spinal laboratorio congiunto di ricerca di base e clinica presso l’IMFR Gervasutta di Udine Continua a leggere →

Onda

E’ nata una nuova onda di stimolazione del midollo spinale che ha dimostrato di essere in grado di attivare nella maniera migliore il CPG (Central Pattern Generator) per la locomozione.

E’ nata nel Laboratorio SPINAL e si chiama FListim

Comparirà sul numero di agosto di “Journal of Neurophysiology”, rivista ufficiale di “The American Physiological Society”, ed è già on-line dal 25 maggio sul sito della stessa rivista. E’ l’articolo di Giuliano Taccola che “racconta” la nascita di una nuova onda di stimolazione del midollo spinale che in vitro ha dimostrato di essere in grado di attivare nella maniera migliore il CPG (Central Pattern Generator) per la locomozione.

posizione del CPG nel midollo spinale

L’articolo si intitola “E’ necessaria un’onda di stimolazione rumorosa per attivare nel modo più efficace i circuiti locomotori”.

Negli ultimi tempi, lo testimoniano gli articoli comparsi nei media, la stimolazione elettrica del midollo spinale sta trovando crescente interesse ed entusiasmo per la sua capacità di riattivare i circuiti locomotori nelle persone che hanno subito una lesione spinale. (vedi l’articolo sul n. 39 del Cochecito)
Solo fino a pochi anni fa c’era un forte scetticismo sul fatto che il CPG esistesse anche nell’uomo. Alcuni ritenevano che fosse presente in mammiferi come i roditori o il gatto e che fosse osservabile solo dalla ricerca di base ma non avesse un analogo nell’uomo e quindi non avesse una possibile applicabilità clinica. Oggi sappiamo che il CPG esiste anche negli uomini, che esiste un circuito di interneuroni spinali in grado di generare l’alternanza ritmica degli arti inferiori che conserva la potenzialità di essere riattivato anche in buona parte delle lesioni spinali umane.

Nella stimolazione, che può essere elettrica ma anche trans-magnetica, finora ci si era concentrati principalmente sulla frequenza (cioè sul numero di stimoli erogati nell’unità di tempo, quanto devono essere ravvicinati questi stimoli), sulla localizzazione (cioè se funziona meglio stimolare il segmento L2 piuttosto che quello sottostante…) e sull’intensità (la potenza con cui viene erogata la stimolazione).

Quello che io ho pensato di fare, utilizzando il nostro modello in vitro, è stato di variare la forma d’onda e i treni di stimolazione (In fisica treno d’onde: onde elettromagnetiche emesse in maniera continuativa in un determinato periodo di tempo). Quindi non un treno di stimoli quadri (Figura) tutti uguali uno dopo l’altro come nel protocollo tradizionale, bensì un’onda elettrica con una intrinseca irregolarità, irregolarità che chiamiamo “rumore”. (Fig. di onda rumorosa)

Come sono arrivato all’onda irregolare

Ho riflettuto sul fatto che nel momento in cui il CPG invia agli arti inferiori il comando per il passo, a loro volta gli arti rimandano al midollo spinale delle informazioni di carattere prevalentemente propriocettivo: pressorio, dolorifico… Quindi se il midollo spinale eroga un segnale motorio di tipo oscillatorio ai muscoli, allo stesso modo deve ricevere una stimolazione ondulatoria dalla periferia.

Come ho proceduto
L’esperimento:

1. In un primo momento perfondo il preparato (che è già immerso in soluzione fisiologica) con NMDA e Serotonina, due agenti eccitatori in grado di attivare sperimentalmente il CPG, che generano oscillazioni ritmiche alternate (il “fictive locomotion”) in uscita dalle radici ventrali ovvero dai nervi motori.

2. campiono e registro una parte di questo segnale (le oscillazioni locomotorie),

3.tramite analisi informatica e trattamento dei dati lo esporto come file di testo,

4. carico il file nel mio stimolatore,

5. erogo questo stimolo elettrico fatto esattamente come l’output motorio (il segnale in uscita), ad una delle radici sensoriali poste dorsalmente dello stesso preparato, ora perfuso con una soluzione di lavaggio, così da non avere più agenti in grado di attivare il CPG (il preparato è in condizione di controllo, di riposo),

6: quindi registro la risposta motoria evocata dai nervi motori.

Onda quadra

Onda rumorosa
Esempio di un tracciato ottenuto dalla registrazione dell’attività dei circuiti spinali durante la locomozione in vitro (Fictive Locomotion). Una volta importato nello stimolatore, lo stesso tracciato è stato utilizzato come stimolo elettrico (FListim). Le oscillazioni sono caratterizzate da un’intrinseca variabilità che comunemente è indicata come rumore e che differisce considerevolmente dai tradizionali treni di impulsi quadri utilizzati in clinica.

Ho confrontato la risposta ottenuta con questa onda di stimolazione con le risposte ottenute dalla stimolazione tradizionale che si usa anche in ambito clinico, costituita da treni di stimoli quadri.

Quello che osservavo nel nostro preparato era un miglioramento notevole sia per numero di cicli che per durata dell’evento locomotorio.
Variando il profilo di stimolo elettrico erogato il nostro preparato era, per così dire, in grado di camminare più a lungo e facendo più passi. Ma c’è stata un’altra sorpresa: usando questa nuova e diversa onda di stimolazione l’intensità della corrente che erogavo era straordinariamente più bassa di quella che si utilizza normalmente. Questo fa pensare che l’onda rumorosa contenga al suo interno una qualche informazione che le dà un accesso privilegiato al CPG .

Rumore
Ci sono già applicazioni cliniche basate sull’osservazione che una adeguata quantità di rumore migliora la performance di una rete di neuroni.

Nel sistema nervoso centrale per esempio esistono protesi cocleari per le persone che non sentono perfettamente e che funzionano meglio quando viene aggiunto un rumore, un fruscio.
Esistono anche delle solette, con dei punti in grado di vibrare, attivate in maniera casuale, che trasmettono meccanicamente la vibrazione alla pianta del piede, facilitando la postura corretta in persone che hanno problemi di equilibrio. Quindi, in qualche modo, sembrerebbe che in alcune situazioni ciò che è più rumoroso dia più informazioni al sistema.

Quando parliamo di rumore, in elettrofisiologia, pensiamo al rumore che si vuole togliere con schermature, filtri analogici e anche digitali, sarebbe il grande nemico delle registrazioni ma sembra essere un amico del m.s. perché fornisce uno stimolo più ricco di informazione anche se è tutto ancora da capire: quanto è rumore o quanto è qualcos’altro.

Quando hai cominciato a pensare a questo progetto?
Ho iniziato nel novembre 2009 almeno per quanto riguarda la parte principale, quando in laboratorio ero solo. Nel luglio 2010 presentai la prima parte dei risultati ad Amsterdam al Forum delle Neuroscienze.

Ha suscitato interesse? Domande?
Si, i consigli che mi hanno dato sono stati ottimi ma l’idea principale era già sviluppata.
La seconda parte del 2010 l’ho utilizzata per aggiungere gli esperimenti che mi hanno suggerito e ho completato la serie con quelli che mi hanno consigliato i referee (gli esperti ai quali ho sottoposto l’articolo che descrive l’onda rumorosa).
E’ stata apprezzata soprattutto l’originalità dell’intuizione, da un punto di vista teorico è una cosa abbastanza semplice: stimolare il midollo con le stesse informazioni che il midollo invia ai muscoli. Un effetto eclatante con un intervento così semplice.

Verifiche
Ho cercato di vedere se, variando alcuni parametri dell’onda, variava la risposta: che cosa succede se erogo un’onda ad una frequenza più alta, quindi più veloce, o se cambio l’ampiezza dei cicli?
Sono stati questi esperimenti che mi hanno permesso di capire che, utilizzando l’onda rumorosa, dovevo applicare intensità molto più basse di quelle che eravamo soliti utilizzare. Questa osservazione all’inizio mi ha messo un po’ in difficoltà perché, applicando l’intensità che eravamo abituati a utilizzare con i tradizionali treni di onde quadre e non ottenevo risultati, non vedevo l’attivazione del passo. Ho cercato di non demoralizzarmi quando certi esperimenti volevano farmi credere che non fosse praticabile…
Quando poi, con attenta critica e grande perseveranza, ho provato a esplorare e a variare l’ampiezza dei cicli, ho visto che, raggiungendo ampiezze d’onda di gran lunga minori a quelle da cui ci saremmo aspettati una risposta, il programma locomotorio si attivava!

Proprio per la critica spietata che bisogna applicare nel lavoro di ricerca, quando osservi una cosa che, anche se ti aspettavi, forse non avresti creduto possibile, provi e riprovi per confutare tutte le variabili che avrebbero potuto trarti in errore. Gli esperimenti che sono seguiti sono stati fatti proprio per confermare che quello che stavo vedendo era il segnale che avrebbe centrato l’obiettivo anche le volte successive.

Perché questa onda di stimolazione funziona meglio del protocollo tradizionale?
In realtà al momento non lo sappiamo, quello che potrebbe aiutarci a chiarire questo punto è l’osservazione che l’analisi cinematica, il profilo del movimento della persona che cammina, non riproduce mai esattamente lo stesso passo. Questo fa pensare che durante il passo vengano attivati ogni volta diversi neuroni spinali e forse uno stimolo elettrico altrettanto variabile potrebbe essere in grado di attivarne di più. (Fig. Courtine et al., 2005)

E’ possibile pensare che il midollo spinale funzioni meglio quando lo si stimola con qualcosa di leggermente diverso dallo stimolo precedente: il cervello spinale (come è stato chiamato il midollo spinale per la sua capacità di essere intelligente) non riproduce semplicemente quello che continui a ripetergli ma ha bisogno di modificazioni continue. Ma queste sono, al momento, solo speculazioni mentre molti esprimenti ci attendono per chiarire questo punto.

COURTINE ET AL, 2005.  In questi esperimenti, durante la locomozione su tapis roulant, tramite registrazioni video venivano seguiti gli spostamenti dei punti degli arti inferiori indicati con il pallino grigio.
Le traiettorie di una gamba durante 6 passi consecutivi venivano ricostruite tramite software e sovraimposte come riportato sotto. Nota che nessun profilo è perfettamente sovrapponibile ad un’altro.

Ingannare il midollo spinale

Per studiare quale fosse la caratteristica che rendeva ottimale l’onda rumorosa ho provato in qualche modo a ingannare il midollo spinale.
Prima gli ho erogato un’onda di stimolazione “ripulita” dal rumore: una sinusoide pura. Non ottenevo la risposta che ottenevo con una sinusoide rumorosa della stessa ampiezza e frequenza.
Ho provato poi ad aggiungere a questa sinusoide pura un rumore artificiale, come quello che si può produrre con un software, il così detto rumore gaussiano che è perfettamente casuale, e anche in quell’occasione ho visto che non bastava l’aggiunta di un rumore artificiale alla sinusoide pura di uguale ampiezza e frequenza dell’onda rumorosa.
Poi ho provato il percorso inverso. Ho preso l’onda rumorosa campionata dall’output motorio e l’ho progressivamente filtrata per farla diventare sempre più liscia, sempre più vicina alla forma di una sinusoide pura che posso creare artificialmente e ho osservato l’effetto opposto: la risposta andava diminuendo. Questo mi ha fatto concludere che l’intrinseca variabilità degli eventi, che chiamiamo rumore e che possiamo registrare dal preparato e usare come onda di stimolazione, ha in qualche modo un accesso privilegiato e quindi ottimale per indurre il pattern locomotorio.

BAMFORD ET AL., 2010Ricostruzione schematica di un impianto di microstimolazione intraspinale nel ratto. A livello dell’ultima vertebra toracica il rigonfiamento lombare del midollo spinale è esposto tramite intervento chirurgico. Quattro microfili sono quindi inseriti nello spazio epidurale e mantenuti in situ da una copertura di colla acrilica fissata al processo spinoso della vertebra soprastante. Le estremità dei microfili sono quindi impiantate sui due lati del midollo in modo da raggiungere gli strati ventrali più interni. L’altra estremità è collegata allo stimolatore elettrico esterno.

Ho presentato questi dati, per la prima volta, nell’agosto dello scorso anno in un seminario ad Edmonton, presso il Department of Cell Biology dell’Università di Alberta. L’uditorio era composto da persone che si occupano di CPG, di midollo spinale, di lesioni spinali, quindi c’era una buona quota di ricercatori clinici o di ricercatori che fanno ricerca su animali in vivo e sono rimasti positivamente sorpresi dai risultati che ho ottenuto.

A Edmonton nel laboratorio dell’ing. Vivian Mushahwar hanno attivato una linea di ricerca di stimolazione intraspinale nel ratto spinalizzato: mettono direttamente nel midollo elettrodi particolarissimi, sottili come capelli, e, attraverso questi, erogano prevalentemente treni di stimoli quadri e osservano l’attività dell’animale. (Fig. Bamford et al. 2010)

Hanno provato ad erogare la tua onda rumorosa?
Questo non lo so. Forse ci stanno lavorando e lo sapremo il prossimo anno. Però i commenti che ho ricevuto facevano riferimento alla possibilità di testare facilmente lo stesso protocollo che ho illustrato loro. Hanno avuto una reazione simile anche molti ricercatori clinici, persone che già applicano la stimolazione, soprattutto epidurale, del midollo spinale, e credo di intuire, dai loro commenti, che cercheranno di cambiare il programma del protocollo di stimolazione con quello da me trovato anche perché si tratta solo di cambiare software.
Reggie Edgerton ha sottolineato la singolarità del lavoro presentato a Brescia nell’ultimo convegno definendolo “unique”.
“Il midollo spinale è intelligente”, sostiene Reggie Edgerton, della divisione di Life Sciences alla University of California di Los Angeles.

Come hai chiamato l’onda rumorosa?
L’ho chiamata FListim: Fictive Locomotion Induced Stimulation e FLinstone è una delle storpiature più frequenti in laboratorio.

STIMOLAZIONE EPIDURALE.
Un elettrodo epidurale è inserito, dorsalmente, a ridosso dei primi segmenti del midollo spinale lombare.

pubblicato sul n.40 El Cochecito agosto 2011

di Giuliano Taccola

Il congresso “Spinal cord function, repair and rehabilitation” tenutosi a Montreal dal 24 al 26 giugno ha rappresentato uno dei momenti più importanti dell’anno per coloro che si dedicano allo studio ed alla cura delle lesioni del midollo spinale.
Il simposio, a scadenza biennale, è nato Continua a leggere →

Il 16 settembre 2005 presso l’Istituto di Medicina Fisica e Riabilitazione , IMFR, Gervasutta  è stato presentato il progetto SPINAL, un laboratorio di ricerca sul midollo spinale: Spinal Patient Injury Neurorehabilitation Applied Laboratory.  I due partner eccellenti: SISSA, Scuola Internazionale di Studi Superiori Avanzati di Trieste, e l’IMFR “Gervasutta” di Udine:  ricerca di base e clinica si incontrano. Continua a leggere →